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电泳分离技术



电泳是带电粒子在电场作用下的迁移。
带正电的粒子向阴极迁移,带负电的粒子向阳极迁移。它们的迁移速率取决于电场强度,粒子(即分子)的净电荷,大小和形状以及分子在其中移动的介质的离子强度,粘度和温度。作为一种分析工具,电泳简单,快速且灵敏度高。由于许多重要的生物分子(例如核酸和蛋白质)都具有可电离的基团,因此它们在任何给定的pH值下都带有电荷。因此,电泳是生物化学和分子生物学中最广泛使用的技术之一。


核酸由于其磷酸盐主链而带负电荷,因此会向阳极迁移。通过电泳分离核酸在支持基质或“凝胶”中进行,最常用的是琼脂糖或聚丙烯酰胺。通常,将凝胶浇铸成薄板状,并带有用于装载样品的孔。将凝胶浸入电泳缓冲液中,电泳缓冲液提供离子以承载电流,并提供某种类型的缓冲液以将pH维持在相对恒定的值。载体基质提供了按大小分离分子的方法,因为它们是多孔凝胶。多孔凝胶可以通过阻止或在某些情况下完全阻止大分子的移动,同时允许较小的分子自由迁移来充当筛子。

琼脂糖是从海藻中提取的多糖。通常以0.5%至2%的浓度使用。琼脂糖浓度越高,凝胶“就越硬”。琼脂糖凝胶具有较大的分离范围,但分离能力较低。通过改变琼脂糖的浓度,可以使用标准电泳技术分离约200至50,000 bp的DNA片段。聚丙烯酰胺凝胶是丙烯酰胺的交联聚合物。聚合物链的长度取决于所用丙烯酰胺的浓度,通常在3.5%至20%之间。聚丙烯酰胺凝胶的分离范围很小,但分离能力非常高。对于DNA,聚丙烯酰胺用于分离小于约500 bp的片段。但是,在适当的条件下,单个碱基对长度不同的DNA片段很容易分辨。与琼脂糖相反,聚丙烯酰胺凝胶被广泛用于分离和表征蛋白质混合物。

对于大多数DNA和RNA样品,在琼脂糖凝胶中进行电泳分离。由于磷酸盐骨架,由于DNA或RNA的任何给定片段中每单位长度的电荷相同,因此所有样品在施加电场的情况下都以相同的迁移率移向阳极。发生在琼脂糖基质中的分离是因为它可以阻止核酸的移动。**的分子穿过凝胶孔的困难**,而最小的分子移动没有太大困难。这样,凝胶电泳期间核酸的迁移率将取决于大小,最小的分子移动最快。

凝胶电泳后,需要对凝胶中的核酸进行染色和可视化。最常用的染色剂是荧光染料溴化乙锭。该分子插入核酸分子,可以在紫外线下观察。凝胶显示对应于具有不同分子量的不同核酸分子群体的条带。片段大小通常以“核苷酸”,“碱基对”或“ kb”(对于数千个碱基对)报告,具体取决于单链或双链DNA是否已分离。通常通过与包含已知长度的线性DNA片段的市售DNA阶梯进行比较来确定片段大小。

到目前为止,已经讨论过的通过电泳分离的核酸处于天然状态。在这种情况下的电泳条件称为非变性。当要确定DNA序列或要确定RNA大小时,使用变性条件。DNA测序凝胶在变性剂(例如尿素和甲酰胺)的存在下运行,并且由于所分析的DNA分子较短,因此使用丙烯酰胺凝胶代替琼脂糖。通过凝胶电泳确定RNA的大小需要用变性剂例如甲醛,乙二醛和甲基汞氢氧化物使RNA变性。

为了鉴定凝胶中特定核苷酸序列的存在,使用了一种称为Southern印迹(如果正在分析DNA)或Northern印迹(正在分析RNA)的技术。在这两种情况下,来自完整凝胶的DNA或RNA都将转移到一块硝酸纤维素膜或尼龙膜上。然后将膜暴露于杂交探针,即具有特定序列的单个DNA片段,要确定其在靶DNA(或RNA)中的存在。对探针DNA进行标记,以便通常可以通过引入放射性或用荧光或发色染料标记分子来对其进行检测。