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DNA测序用水



DNA测序可以看作是三种技术或步骤的组合:
  • 步骤1:通常通过基于PCR的技术生成DNA片段
  • 步骤2:通过毛细管或常规琼脂糖凝胶电泳分离片段
  • 步骤3:检测步骤,最常见的是荧光检测。 
水质对每个步骤的影响将在单独的部分中介绍。

这里简要介绍了水质的影响。用于操作DNA测序仪的水质应符合某些质量标准,以优化测序过程。

无核酸酶的水
建议使用无核酸酶的水,以避免在DNA测序的所有步骤中DNA降解。使用超滤设备可以有效地去除核酸酶(请参阅无RNase的水部分)。使用点超滤滤芯可以安装在净水系统的出口,以根据需要提供无核酸酶的水。

有机物
有机物是DNA测序中**破坏性的污染物。实际上,有机物的高负载会损害毛细管内部或较大凝胶中的凝胶电泳过程。天然物质降解产生的大型有机酸,例如腐殖酸和富里酸,在电泳过程中可能与DNA片段共洗脱,并且在PCR步骤中也会干扰聚合酶的效率。另外,更常见的是,某些有机物会干扰荧光检测并导致所分析目标DNA测序的错误。实际上,大多数测序技术都是基于对附着在DNA片段上的荧光染料的检测。荧光吸收和猝灭有机分子的存在会干扰检测。

为了确保用于DNA测序的高纯水的有机纯度,建议使用总有机碳含量较低的有机碳,即总有机碳(TOC)。在高纯水净化系统中,TOC的规格<5 ppb(µg / L)。

离子
在PCR步骤中,需要仔细调节某些离子(例如镁)的含量,以优化聚合酶的效率。必须除去其他离子,镉和一些其他二价阳离子,以防止抑制聚合酶。当所用的水具有高纯度且不包含未知浓度的离子时,也可以**地获得和控制电泳过程中所需的离子力。

高电阻率(18.2MΩ•cm)确保水中的离子含量低(总离子浓度低于1 µg / L)。高纯度水净化系统旨在按需提供连续的高电阻率水。

细菌
细菌可以在水中释放核酸酶,因此,应将其去除以避免核酸降解。细菌还会释放出可能干扰目标DNA片段电泳分离的DNA。另外,如前所述,细菌会释放离子和有机物,这两种污染物都会干扰DNA测序。

通过在整个净化过程中结合技术和维护建议,可以使用水净化系统控制细菌的水平。膜技术,**微滤或超滤为0.2 µm,可在交货时去除细菌,并确保细菌水平<0.1 cfu / mL。254 nm的杀菌紫外线。

总体而言,在测序步骤中,水质应符合以下标准:
  • 无核酸酶
  • 高电阻率(18.2MΩ•cm)
  • 有机物含量低(TOC <5 ppb)
  • 低细菌数(<1 cfu / mL) 
DNA测序仪制造商还使用水来制备毛细管。水质对于该步骤很重要,尽管科学家在购买设备时对毛细管制备没有太多控制。
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